Фибрилляция предсердий (ФП) остается значимой проблемой для системы здравоохранения в связи с увеличением частоты в популяции и рисками развития осложнений [1]. В современных рекомендациях в полном объеме отражены возможности антиаритмической терапии, хирургической коррекции, направленные на восстановление синусового ритма, а также определены стратегии антикоагулянтной терапии, направленные на минимизацию возникновения тяжелых тромбоэмболических событий и в первую очередь кардиоэмболического инсульта (КЭИ) [2]. Однако следует отметить, что больные с ФП - это лица, имеющие множество сопутствующих заболеваний, и именно коморбидность во многом определяет как текущее состояние пациента, так и риски развития осложнений. Множественность поражений на уровне макро- и микроциркуляторного русла у пациентов с ФП с развитием каскада патофизиологических реакций, приводящих к ишемии органов и тканей, требует особого внимания. В настоящее время сформулирована концепция системного атеротромботического гемодинамического синдрома, в рамках которого активно обсуждаются роль и участие сосудов микроциркуляторного русла [3]. Изучение механизмов нарушения микроциркуляции (МЦ) у пациентов с ФП приобретает большое клиническое значение в условиях активной антикоагулянтной терапии. Достаточный уровень оксигенации органов и тканей обеспечивается целым рядом сосудистых эффектов, а также морфофункциональными характеристиками эритроцитов. Важнейшим элементом эритроцита является его мембрана, поддерживающая структуру цитоскелета, обеспечивающая упругость и достаточную степень деформации при прохождении на уровне микрососудов. Мембранный скелет эритроцитов был впервые визуализирован методом электронной микрофотографии в 1973 г. и в дальнейшем изучен достаточно подробно [4]. В целом ряде работ продемонстрированы структурно-организационная роль белков мембраны эритроцита и их участие в изменении геометрических свойств мембраны и эритроцита в целом [5]. В настоящее время мы имеем достаточно глубокие знания о структуре мембраны эритроцита, тем не менее, необходимы дальнейшие исследования, направленные на выявление фактов, влияющих на изменчивость и функциональную активность цитоскелета эритроцита [6, 7]. Показано, что мембрана эритроцита реагирует на различные стимулы, изменения внутренней среды, а также внешние воздействия. Так, в ряде работ показаны изменения структуры мембран эритроцитов в условиях лазерного излучения, алкогольного опьянения, воздействия токсинов [8-10].
В связи с этим представляет интерес изучение клинических состояний, при которых возникают повреждение мембраны и нарушение двояковогнутой формы эритроцита, и возможностей их фармакологической коррекции с использованием современных диагностических методов.
Нами выдвинута гипотеза о возникновении изменений структуры мембраны эритроцитов в условиях нарушений процессов микроциркуляции у пациентов с ФП, а также возможности их коррекции антикоагулянтами. Проведенный при подготовке данного материала анализ исследований и доказательных материалов, результаты которых опубликованы и доступны на таких ресурсах, как PubMed, EMBASE, Cochrane, E-Library, выявил отсутствие подобных работ.
Целью нашей работы стало изучение влияния антикоагулянтной терапии на оксигенацию мембран эритроцитов во взаимосвязи с показателями микроциркуляции у пациентов с ФП.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Проведено одномоментное (cross-sectional) исследование с последовательным включением больных с ФП, перенесших КЭИ, находящихся на амбулаторном этапе наблюдения. Пациенты были разделены на две группы: в основную - 1-ю группа больных (n=50), вошли пациенты, принимающие в соответствии с рекомендациями антикоагулянты, в группу сравнения включены больные, которые при наличии рекомендаций не принимают антикоагулянты [2-я группа (n=50)].
Критерии включения в исследование: 1) ФП неклапанного генеза; 2) подтвержденный КЭИ в каротидном бассейне давностью ≤60 дней; 3) отсутствие гемодинамически значимого стеноза в бассейне сонных артерий (по данным ультразвукового исследования). Критерии невключения: 1) заболевания щитовидной железы; 2) онкологические, гематологические заболевания в анамнезе; 3) диффузные заболевания соединительной ткани; 4) психические заболевания. Группу контроля (3-я группа, n=50) составили пациенты без ФП и инсульта, сравнимые по полу и возрасту с больными 1-й и 2-й групп. Группа контроля была сформирована с целью калибровки изучаемых нормированных значений параметров мембран эритроцитов и МЦ статуса. К лицам группы контроля предъявлялись дополнительные отборочные критерии: отсутствие сопутствующей патологии в виде сахарного диабета (СД) и хронической болезни почек (ХБП).
Изучение морфофункциональных параметров мембраны эритроцитов, отражающих уровень оксигенации, проводили с помощью метода лазерной интерференционной микроскопии (ЛИМ), являющегося неинвазивным методом получения высококонтрастных изображений биологических объектов, не требующим предварительной фиксации и окраски, что позволяет количественно оценивать оптические свойства нативной клетки. Принцип действия ЛИМ основан на измерении локальных фаз излучения. Исследования проводили на компьютерном лазерном фазово-интерференционном микроскопе МИМ-340 ("Швабе", Россия), укомплектованном лазером с длиной волны 670 нм. Микроскоп МИМ-340 имеет два канала для регистрации изображения: навигационный канал и измерительный. Выбор объекта микрокопирования и настройка фокуса изображения проводятся в навигационном канале. Последующая настройка интерференционного изображения (в нашем случае интерференционного "портрета" эритроцита), яркость лазера и запись интерференограммы осуществляются в измерительном канале. Для проведения исследований использовали 20-кратный микрообъектив с числовой апертурой 0,65 (MPLFLN Olympus). Увеличение в канале регистрации составляет х150. Метод подготовки эритроцитов к микроскопированию: проводили забор крови из локтевой вены пациентов в вакуумную пробирку VACUETTE с К3 ЭДТА, перемешивали. Далее 10 мкл цельной крови помещали в 1 мл фосфатно-солевого буфера (рН 7,4), из полученной суспензии клеток отбирали 10 мкл и помещали в камеру Горяева с зеркальным напылением, после чего проводили снятие интерференционного портрета с 40-50 эритроцитов в пробе каждого больного. Обработка изображений осуществлялась в программе MIM Visualiser 1.0. Измеряли следующие параметры: максимальную (dy1) и минимальную (dy2) фазовую высоту клетки. Вычисляли индекс оксигенации мембраны эритроцита как отношение минимальной фазовой высоты к максимальной dy2/dy1. В группе контроля нами установлены нормированные размеры: для dy1 - от 120,0 до 155,0 нм; dy2 - от 10,0 до 38,0; dy2/dy1 - от 0,085 до 0,2 нм.
Изучение параметров МЦ проводили с помощью метода лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) на лазерном анализаторе микроциркуляции крови для врача общей практики "ЛАКК-ОП" (ООО Научно-производственное предприятие "Лазма", лазерный анализатор микроциркуляции крови для врача общей практики "ЛАКК-ОП"). Принцип действия метода заключается в обнаружении изменений длины волны, отраженной от ритмически движущихся эритроцитов и других форменных элементов крови в микрососудистом русле. С помощью лазерных датчиков показатели снимали с подушечек указательных пальцев. Общее время проведения пробы составило 15 мин, из которых 5 мин осуществлялась регистрация исходного кровотока, 15 с - дыхательная проба, в течение следующих 3 мин 45 с - восстановление кровотока после пробы, 3-минутная окклюзия, и в течение последующих 3 мин регистрировалось восстановление кровотока после окклюзии. Полученные результаты анализировались автоматически с помощью программного обеспечения ЛДФ. В ходе исследования определялись следующие показатели микроциркуляции:
1) М (пф.ед.) - средняя перфузия за время обследования;
2) Kv = σ/Мх100% - коэффициент вариации, отражающий состояние микроциркуляции;
3) Аэ/σ, Ан/σ, Ам/σ - нормированные значения амплитуд колебаний микрокровотока, соответственно связанные с эндотелиальной, нейрогенной и миогенной регуляциями микрососудов;
4) РКК - резерв микрокровотока при окклюзионной пробе;
5) I - индекс удельного потребления кислорода в ткани;
6) Sm - индекс относительной перфузионной сатурации кислорода в микрокровотоке [11]. Исходные ЛДФ-граммы подвергали спектральному анализу с использованием адаптивного вейвлет-преобразования. В качестве материнской функции использовали комплекснозначный вейвлет Морле. Усредненную по времени амплитуду осцилляций кровотока оценивали по максимальным значениям (Amax) в соответствующем частотном диапазоне: 0,0095-0,021 Гц - диапазон эндотелиальной активности (Аэ); 0,021-0,052 Гц - диапазон нейрогенной (симпатической) активности (Ан); 0,052-0,145 Гц - диапазон миогенной активности (Ам).
Статистический анализ полученных данных выполняли с помощью пакета IBM SPSS Statistics 21 (лицензия № 20130626-3). Для сравнения независимых групп применяли однофакторный дисперсионный анализ (one-way ANOVA), при отклонении от нулевой гипотезы о равенстве средних в группах проводили апостериорные тесты (сравнения групп попарно) по критерию Тьюки. Для сопоставления показателей в динамике применяли дисперсионный анализ повторных измерений. Исследование взаимосвязей выполняли с помощью корреляционного анализа Пирсона. Описание нормально распределенных количественных признаков приведено с указанием среднего значения признака и среднего квадратичного отклонения (M±SD). Для анализа использована описательная статистика с применением параметрического критерия (t-критерия Стьюдента). Для описания признаков с распределением, отличным от нормального, указывали медиану, верхний (25-й) и нижний (75-й) квартили - Me [Q25; Q75]. Различия между изучаемыми параметрами признавали статистически значимыми при р<0,05.
Исследование было выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice) и принципами Хельсинкской декларации. Протокол исследования одобрен этическим комитетом Самарского государственного медицинского университета. Все сведения о наличии сопутствующих заболеваний пациента были получены нами из электронной базы данных системы "АИС Поликлиника" и зафиксированы в первичной медицинской документации по кодам МКБ-10.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Исходная задача по формированию групп в рамках протокола исследования была выполнена нами в полном объеме. Исследуемые лица 1-й и 2-й групп были сопоставимы по основным гендерно-демографическим и клиническим характеристикам, представленным в табл. 1. Больные этих групп не отличались по давности перенесенного инсульта, степени выраженности неврологического дефицита, а также по наличию сопутствующей патологии. Установлены статистически значимые отличия лиц группы контроля по сравнению с пациентами 1-й и 2-й групп по параметрам липидного спектра крови, скорости клубочковой фильтрации (СКФ), уровню глюкозы. Эти данные подтверждают, что включенные в исследование больные с ФП - это лица с коморбидным статусом, имеющие в анамнезе ряд заболеваний, отягощающих состояние пациента. Данное обстоятельство изначально прогностически неблагоприятное в аспекте рисков развития тром-боэмболического события и смертности.
По результатам исследования нами установлены изменения морфологических свойств мембран эритроцитов с их множественными деформациями и повышением агрегации эритроцитов у пациентов с ФП, перенесших КЭИ в 1-й и 2-й группах. Так, на рис. 1-3 представлены примеры визуализации нативных эритроцитов пациентов из каждой группы, где отмечены зоны высокой плотности агрегированных эритроцитов, наиболее выраженные в группе сравнения. Следует отметить, что в рамках визуализационного поля у больных с ФП, не принимавших антикоагулянты, коэффициент распределения агрегированных эритроцитов был значительно выше, чем у больных 1-й группы и группы контроля.
Подробно изучаемые параметры состояния мембран эритроцитов и микроциркуляции пациентов исследуемых групп представлены в табл. 2.
У больных 1-й и 2-й групп отмечались статистически значимые более низкие параметры показателей мембраны эритроцитов, чем у лиц группы контроля, со снижением индекса оксигенации ниже нормированных значений. При сравнении данного параметра в 1-й и 2-й группах выявлено, что у пациентов, не принимавших антикоагулянты, наблюдалось статистически значимое (р=0,001) низкое значение индекса оксигенации мембраны эритроцитов по отношению к данному параметру у лиц основной группы. На рис. 4-9 представлены примеры полученных параметров эритроцитов с отражением фазового профиля высоты их мембраны и интерференционного "портрета".
По результатам исследования обнаружены статистически значимые различия у пациентов 1-й и 2-й групп, отражающие отрицательные показатели МЦ-статуса с нарушениями эндотелиальной, нейрогенной, миогенной регуляции микрососудистого тонуса, с низким индексом относительной перфузионной сатурации кислорода в микрокровотоке и показателя I. Следует отметить, что показатель М, отражающий степень снижения перфузии кровотока, был статистически значимо ниже (в группе пациентов, не принимавших антикоагулянты) по сравнению с аналогичным показателем в основной группе. Проведенный сравнительный анализ нормированных значений амплитуд колебаний микрокровотока, связанных с эндотелиальной, нейрогенной и миогенной регуляцией микрососудистого тонуса, выявил тенденцию к повышению показателя Аэ/а во 2-й группе больных по сравнению с группой контроля. Показатель Ам/а, отражающий миогенный компонент регуляции, у пациентов 2-й группы был статистически значимо ниже по сравнению с 1-й группой. Аналогичные изменения отмечены при сравнении параметра Ан/а. В части изучения индекса удельного потребления кислорода в ткани в группе пациентов, не принимавших антикоагулянты, отмечено снижение показателя по сравнению с пациентами основной группы.
Для уточнения характера влияния изменения параметров МЦ на показатели мембраны эритроцита проведен корреляционный анализ. Нами отмечено, что у пациентов 1-й и 2-й групп были статистически значимые изменения показателей МЦ, коррелирующие с измеряемыми параметрами мембран эритроцитов. Показатель Sm как основной параметр, отражающий степень насыщения кислородом микрокровотока, у пациентов 2-й группы статистически значимо коррелировал с индексом dy2/dy1 (r=-0,66; р=0,028). По параметрам, отражающим эндотелиальную, нейрогенную и миогенную регуляцию микрососудов, также были отмечены корреляционные связи с индексом dy2/dy1: Аэ/σ (r=-0,61; р=0,012); Ан/σ (r=-0,66; р=0,002); Ам/σ (r=-0,70; р=0,001).
ОБСУЖДЕНИЕ
Полученные результаты - это первые данные по состоянию оксигенации мембраны эритроцитов во взаимосвязи с показателями микроциркуляторного статуса у пациентов с ФП, перенесших тромбоэмболическое событие. Проведенный нами анализ позволяет не только интерпретировать показатели оксигенации эритроцитов и сравнивать с нормированными значениями, полученными в группе лиц без ФП, но и их изменения на фоне антикоагулянтной терапии, тем самым в перспективе оценивать эффективность антикоагулянтной терапии. Безусловно, пациенты, включенные в исследование, ввиду коморбидности состояния представляют выборку лиц с высоким уровнем ишемических процессов в органах и тканях, особенно на уровне микрососудистого русла. Как сами изменения параметров микроциркуляции, так и невозможность эритроцитами в полной мере осуществлять оксигенирование органов и тканей, являются негативными патофизиологическими процессами, потенциально приводящими к развитию неблагоприятных клинических исходов.
Сохранение функциональной способности эритроцитов к их физиологической деформации крайне важно. Эритроциты неоднократно претерпевают деформации при прохождении через узкие кровеносные сосуды. Высокая гибкость эритроцитов в основном определяется состоянием клеточной мембраны, так как сама клетка лишена ядра и большинства органелл. Цитоскелет играет важную роль в целостности мембраны эритроцитов, дефекты мембранных белков приводят к изменениям мембраны и снижению ее механической прочности [12, 13]. В ряде экспериментальных работ показано изменение локальной жесткости мембран эритроцитов с отрицательным влиянием на параметры гемодинамики [14-16]. Полученные нами данные в первую очередь свидетельствуют о том, что эритроциты при ФП в условиях нарушений микроциркуляции имеют патологическую деформацию мембраны, что определяет мембранную ригидность с формированием значимого пула в периферической крови, так называемых жестких эритроцитов. Жесткие эритроциты не способны изменять свою форму в достаточной степени для продвижения по микроциркуляторному руслу, а их мембрана имеет низкий уровень оксигенации, способствующий усугублению ишемии на уровне органов и тканей у пациентов с ФП. Нарушение реологических параметров крови с повышением степени агрегации эритроцитов и нарушением их способности к физиологической деформации, на наш взгляд, является важнейшим патофизиологическим механизмом, вносящим значимый вклад в тяжесть состояния больного с ФП. По существу имеет место системный процесс нарушения микроциркуляции при ФП, особенно у лиц, перенесших тромбоэмболическое событие.
Так, в работе А.В. Муравьева и соавт. (2013) подробным образом рассматриваются аспекты взаимоотношения изменений деформируемости эритроцитов и нарушение степени перфузии органов и тканей на уровне МЦ русла [17]. Ссылаясь также на другие фундаментальные исследования, авторы в своей работе подчеркивают, что снижение деформируемости эритроцитов нарушает локальную перфузию тканей, так как микрореологические свойства эритроцитов в наибольшей степени проявляются на уровне МЦ [18, 19].
Полученные нами данные отражают, на наш взгляд, важные аспекты антикоагулянтной терапии, которые ранее не были описаны у пациентов с ФП. Антикоагулянты как класс лекарственных средств оказывают свое основное действие на систему гемостаза, влияя на ее плазменное звено. Результаты сравнения пациентов 3 групп с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA (для несвязанных групп) показали, что параметры МЦ-статуса пациентов 1-й группы были статистически значимо лучше, чем показатели во 2-й группе. В отношении индекса оксигенации, мембраны эритроцитов полученные данные свидетельствуют, что данный показатель был статистически значимо ниже нормированных значений, определяемых в 3-й группе, для больных и 1-й, и 2-й группы, однако у пациентов 2-й группы он был существенно ниже (р=0,017), чем у больных, принимавших антикоагулянты.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Наше исследование стало пилотным в отношении изучения параметров микроциркуляции во взаимосвязи со степенью оксигенации мембраны эритроцитов у больных с фибрилляцией предсердий, перенесших тромбоэмболическое событие.
Полученные данные позволяют говорить, что у пациентов с ФП отмечаются выраженные нарушения микроциркуляции с формированием "жестких" эритроцитов, что усугубляет процессы ишемии органов и тканей.
Результаты исследования свидетельствуют о положительном влиянии антикоагулянтной терапии на показатели микроциркуляторного статуса и степень оксигенации эритроцитов у больных с ФП.
Декларация о финансовых и других взаимоотношениях
Все авторы принимали участие в разработке концепции статьи и в написании рукописи. Исследование не имело спонсорской поддержки. Исследование не преследовало цель оценить клиническое превосходство какого-либо конкретного лекарственного средства. В случае возникновения спорных вопросов авторы готовы предоставить протокол исследования и первичную документацию в полном объеме. Авторы несут полную ответственность за предоставление окончательной версии рукописи в печать.
ЛИТЕРАТУРА
1. Camm J.A., Singer D.E. Device-detected atrial fibrillation and risk for stroke: an analysis of >10,000 patients from the SOS AF project (Stroke prevention Strategies based on Atrial Fibrillation information from implanted devices) // Eur. Heart J. 2014. Vol. 35, N 8. P. 508-516.
2. Kirchhof P., Benussi S., Kotecha D. et al. 2016 ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation developed in collaboration with EACTS // Eur. Heart J. 2016. Vol. 37, N 38. P. 2893-2962.
3. Kario K. Systemic hemodynamic atherothrombotic syndrome and resonance hypothesis of blood pressure variability: triggering cardiovascular events // Korean Circ. J. 2016. Vol. 46, N 4. P. 456-467. Published online 2016 Jul 21. doi: 10.4070/kcj.2016.46.4.456.
4. Yu J., Fischman D.A., Steck T.L. Selective solubilization of proteins and phospholipids from red blood cell membranes by nonionic detergents // J. Supramol. Struct. 1973. Vol. 1. P. 233-248.
5. Khan A.A., Hanada T., Mohseni M., Jeong J.J. et al. Dematin and adducing provide a novel link between the spectrin cytoskeleton and human erythrocyte membrane by directly interacting with glucose transporter-1 // J. Biol. Chem. 2008. Vol. 283. P. 14 600-14 609.
6. Fowler V.M. The human erythrocyte plasma membrane: a Rosetta Stone for decoding membrane-cytoskeleton structure // Curr. Top. Membr. 2013. Vol. 72. P. 39-88. doi: 10.1016/B978-0-12-417027-8.00002-7.
7. Li H., Lykotrafitis G. Erythrocyte membrane model with explicit description of the lipid bilayer and the spectrin network // Biophys J. 2014. Vol. 107, N 3. P. 642-653. doi: 10.1016/j. bpj.2014.06.031.
8. Kujawa J., Zavodnik L., Zavodnik I., Buko V. et al. Effect of low-intensity (3.75-25 J cm-2) near-infrared (810 nm) laser radiation on red blood cell AT Pase activities and membrane structure // J. Clin. Laser Med. Surg. 2004. Vol. 22, N 2. P. 111117. doi: 10.1089/104454704774076163.
9. Bulle S., Reddy V.D., Padmavathi P., Maturu P. et al. Association between alcohol-induced erythrocyte membrane alterations and hemolysis in chronic alcoholics // J. Clin. Biochem. Nutr. 2017. Vol. 60, N 1. P. 63-69. doi: 10.3164/jcbn.16-16.
10. Reddy V.D., Padmavathi P., Paramahamsa M., Varadacharyulu N. Modulatory role of Emblica officinalis against alcohol induced biochemical and biophysical changes in rat erythrocyte membranes // Food Chem. Toxicol. 2009. Vol. 47. P. 19581963.
11. Крупаткин А.И., Сидоров В.В. Лазерная допплеровская флоуметрия микроциркуляции крови : руководство для врачей. М. : Медицина. 2005. 256 с.
12. Fisseha D., Katiyar V.K. Analysis of mechanical behavior of red cell membrane in sickle cell disease // Appl. Mathematics. 2012. Vol. 2, N 2. P. 40-46.
13. Коркушко О. В., Дужак Г. В. Возрастные изменения реологических свойств крови и состояния эндотелиальной функции микроциркуляторного сосудистого русла // Проблемы старения и долглетия. 2011. Vol. 20, N 1. P. 35-52.
14. Сергунова В.А., Гудкова О.Е., Козлов А.П., Черныш А.М. Измерение локальной жесткости мембран эритроцитов с помощью атомно-силовой спектроскопии // Общ. реаниматол. 2013. Т. 9, № 1. С. 14.
15. Мороз В.В, Голубев А.М, Афанасьев А.В., Кузовлев А.Н. и др. Строение и функция эритроцита в норме и при критических состояниях // Общ. реаниматол. 2012. Т. 8, № 1. С. 52-60.
16. Ефремов Ю.М., Багров Д.В., Дубровин Е.В., Шайтан К.В. и др. Атомно-силовая микроскопия животных клеток: обзор достижений и перспективы развития // Биофизика. 2011. Т. 56, № 2. С. 288-303.
17. Муравьев А.В., Комлев В.Л., Михайлов П.В., Ахапкина А.А. и др. Деформация эритроцитов: роль в микроциркуляции // Ярослав. педагог. вестн. 2013. Т. III (Естественные науки), № 2. С. 93-100.
18. Tse W.T., Lux S.E. Red blood cell membrane disorders // Br. J. Haematol. 1999. Vol. 104. P. 2-13.
19. Eber S., Lux S.E. Hereditary spherocytosis - defects in proteins that connect the membrane skeleton to the lipid bilayer // Semin. Hematol. 2004. Vol. 41. P. 118-141.
20. Delaunay J. The molecular basis of hereditary red cell membrane disorders // Blood Rev. 2007. Vol. 21. P. 1-20.