Тромболитический потенциал стафилокиназы был выявлен в 1964 г.: этот тромболитик сначала испытывали в двух сериях экспериментов на собаках [1]. Собакам вводили стафилокиназу в бедренную артерию системно и внутриартериально. Результаты проведенных экспериментов обескуражили, так как препарат показал себя как тромболитик, вызывающий полную деградацию фибриногена и сильные кровотечения.
При ретроспективном анализе результатов исследования было обнаружено, что фибринолитическая система собак и человека по-разному реагирует на введение стафилокиназы. Оказалось, что низкая фибринселективность тромболитика у собак обусловлена замедленным ингибированием α2-антиплазмином плазмин-стафилокиназного комплекса. Таким образом, выбор плазмы собак для первоначальной оценки стафилокиназы in vivo привел к ошибочному выводу о неперспективности этого тромболитика [2].
Ошибочность изначальных заключений об эффективности и безопасности стафилокиназы в последующем подтвердили эксперименты, проведенные на хомяках и бабуинах [1, 2]. В опыте на хомяках проводилось сравнительное исследование стафилокиназы и стрептокиназы на модели легочной тромбоэмболии. Животные были поделены на 3 группы: 1-й группе вводили тромбы из человеческой плазмы, обедненной тромбоцитами, 2-й группе - тромбы, богатые тромбоцитами (3х105 тромбоцитов/ммоль), 3-й группе - тромбы, насыщенные тромбоцитами (1,5х106 тромбоцитов/ммоль). При определении тромболитической активности стафилокиназа и стрептокиназа показали относительно сопоставимые результаты в группах с тромбами с обедненными и богатыми тромбоцитами. Однако в 3-й группе хомяков, где тромбы состояли из человеческой плазмы, насыщенной тромбоцитами, эффективность стафилокиназы оказалась в 5 раз выше по сравнению со стрептокиназой. У бабуинов внутривенное введение как стрептокиназы, так и стафилокиназы вызывало одинаковый дозозависимый фибрин-селективный лизис фибрина, меченного аутологическими тромбоцитами, но при применении стафилокиназы реканализация на модели богатого тромбоцитами артериального тромба достигалась чаще и более продолжительное время, чем при стрептокиназе.
Среди тромболитиков III поколения (алтеплаза, тенектеплаза, стафилокиназа), по мнению одного из ведущих кардиологов Европы M. Verstraete, наиболее фибринселективным является стафилокиназа [3]. Этого же мнения придерживаются и другие исследователи [4], а D. Collen называет стафилокиназу уникальным фибринселективным тромболитиком [1]. Механизм действия фибрин-селективного тромболитика основано на связывании только с тем фибрин-фибриногеном, который находится на тромбе, и игнорировании фибриногена, находящегося в системном кровотоке, что не приводит к массивным кровотечениям. В противоположность этому фибрин-неселективный тромболитик, например стрептокиназа, связывается как с фибрин-фибриногеном, находящимся на тромбе, так и с циркулирующим фибриногеном, приводя к массивным кровотечениям. Фибринселективность тромболитика обусловливает и его дозозависимый клинический эффект. По данным M. Verstraete, доза умеренно селективного тромболитика алтеплазы равна 100 мг, селективного тромболитика тенектеплаза - 50 мг, а наиболее селективного тромболитика стафилокиназы -15-20 мг [3]. В рандомизированных сравнительных исследованиях стафилокиназа vs алтеплаза в виде болюсно-инфузионного способа введения у больных острым инфарктом миокарда с подъемом сегмента ST (ИМпST) было показано преимущество стафилокиназы по эффективности (частота коронарной реперфузии) и безопасности (наличие кровотечений и минимальное снижение фибриногена крови, плазминогена, α2-антиплазмина) (см. рисунок) [5, 6]. Основным недостатком стафилокиназы, применявшейся в этих исследованиях, было образование нейтрализующих антистафилокиназных антител, что не позволяло вводить ее повторно.
&hide_Cookie=yes)
Появление нейтрализующих антистафилокиназных антител было ожидаемо. Ген стафилокиназы был клонирован из бактериофагов sakǿC и sak42D [7], a также из геномной ДНК (sakSTAR) лизогенного штамма Staphylococcus aureus. Экспрессию гена проводили под контролем промотора λPR и его трансляционных сигналов в Escherichia coli. Стафилокиназный ген кодирует белок из 163 аминокислот с аминокислотой 28, соответствующей NН2-концевому остатку зрелой стафилокиназы полной длины [2, 8]. Таким образом, применение стафилокиназы, подобно стрептокиназе, необходимо ограничивать единственным введением. С учетом того, что уровни уже сформированных антистафилокиназных антител в общей популяции ниже, чем антистрептокиназных, в проведенных исследованиях введение стафилокиназы не вызывало развития аллергических реакций. Однако у большинства пациентов через
2 нед после введения препарата выявляли нейтрализующие антистафилокиназные IgG, которые сохранялись на протяжении 2 мес. В связи с этим следует избегать повторного применения стафилокиназы со 2-й недели после первого введения. Пациенты с высокими титрами антител не только невосприимчивы к тромболитическому действию препарата, но и подвержены высокому риску развития аллергических реакций, в том числе анафилактического шока.
Именно иммуногенность стафилокиназы препятствовала ее широкому применению. В связи с этим стали использовать генную инженерию для снижение иммунногенности препарата. Было выявлено, что стафилокиназа дикого типа (sakSTAR) состоит из 3 иммунодоминантных эпитопов, и с помощью специфичного сайт-направленного мутагенеза две антигенных детерминанты могут быть убраны без снижения фибринолитической активности.
В ходе проведенных экспериментов было получено несколько модификаций стафилокиназы дикого типа. Так, D. Collen с группой ученых создали 21 производную молекулы нативной стафилокиназы. Некоторые из них были неактивными, другие реагировали с панелью моноклональных антител, как и нативная стафилокиназа. Все 3 производных оказывали тромболитический эффект, но слабо реагировали с панелью антител [9].
Параллельно этим исследованиям L. Moons создал мутантную полиэтиленгликолевую молекулу с заменой аминокислоты цистеина на серин в кластере 3, сокращенное название молекулы - SY 161-P5 [10]. Таким образом, исследователям удалось увеличить период полувыведения молекулы, чтобы можно было назначать исследуемый препарат однократным болюсом. Но при испытаниях этого препарата на крысах, мышах, хомяках и кроликах был обнаружен кардиотоксический эффект. При секционном исследовании у животных выявляли миокардит с умеренной или минимальной активностью. Хотя в выводах исследователи указали, что мутантная стафилокиназа по кардиотоксичности аналогична нативной стафилокиназе и стрептокиназе, больше в литературе не найдено описаний последующих исследований SY 161-P5.
Фортелизин® - отечественный фибринселективный тромболитик. В 2012 г. Минздрав РФ зарегистрировал оригинальный тромболитический препарат Фортелизин® (ЛП-001941 от 18.12.2012) для лечения больных ИМпST. Фортелизин® - это рекомбинантный белок E. coli, полученный по генно-инженерной технологии и содержащий аминокислотную последовательность неиммуногенной стафилокиназы. Для его создания был сконструирован ген Sak7-457, получена сначала рекомбинантная плаз-мида pZT11, несущая этот ген под контролем промотора бактериофага Т5, а затем синтезирован штамм-продуцент неиммуногенной стафилокиназы Sak7-457 (E. coli MZ09) с заменой аминокислот в иммунодоминантном эпитопе белка.
Были разработаны инновационные способы хроматографической очистки лекарственной субстанции Фортеплазе® на СМ- и DEAE-сефарозах и на G-25-сефадексе. Создан оригинальный состав вспомогательных веществ для получения готовой лекарственной формы, отработаны промышленные технологии лиофильной сушки, позволяющие сохранять фибринолитическую активность препарата Фортелизин® на протяжении всего 3-летнего срока годности.
Проект создания инновационного отечественного лекарственного препарата Фортелизин® осуществлялся с участием ведущих медицинских и научных центров (МГУ им. М.В. Ломоносова, Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, РУДН, НИИ кардиологии СО РАМН и др.) и занял более 12 лет [11, 12]. При разработке субстанции и лекарственной формы препарата Фортелизин® были учтены требования Российской, Британской, Европейской и Американской фармакопей.
Доклинические и клинические исследования препарата Фортелизин® проходили в ведущих кардиологических клиниках и региональных сосудистых центрах России и показали, что восстановление коронарного кровотока, по данным ангиографии, происходит не менее чем в 80% (критерии TIMI 2-3), по данным электрокардиографии (снижение сегмента ST) - не менее чем в 85% случаев. Отмечена незначительная доля малых кровотечений из мест пункций, геморрагических инсультов не было, что, по-видимому, обусловлено минимальным снижением циркулирующего фибриногена (7%). Такое незначительное снижение фибриногена при введении Фортелизина® подтверждает предыдущие исследования стафилокиназы как самого фибринселективного среди всех существующих тромболитиков. Подробно результаты доклинического и клинических исследований Фортелизина® были опубликованы ранее [13, 14].
Производство лекарственного препарата Фортелизин® осуществляется в соответствии с действующими в РФ нормативными актами и правилами Good Manufactured Practice (Лицензия № 00204-ЛС от 08.06.2016).
Мониторинг эффективности и безопасности препарата Фортелизин® осуществляется постоянно, с июня 2013 по март 2017 г. он охватил 4123 больных с ИМпST. Средний возраст больных, которым вводился Фортелизин®, составил 64 года, старше 75 лет было 610 человек, мужчины со- ставили 72% от общего числа больных. По локализации патологии преобладал передний инфаркт миокарда (табл. 1).
&hide_Cookie=yes)
Время от начала симптомов инфаркта миокарда до введения препарата Фортелизин® составило 206 мин. Признаки реперфузии миокарда, по данным ЭКГ, к 90-й минуте при неинвазивной стратегии отмечались у 2542 из 3139 больных, что составило 81%, при фармакоинвазивной стратегии - у 826 из 984 больных (83%).
При фармакоинвазивной стратегии (ТЛТ + ЧКВ), по данным коронарной ангиографии восстановление коронарного кровотока по критериям TIMI 3 наблюдалось у 403 из 984 больных (41%), по критерию TIMI 2 - у 305 больных (31%), всего по сумме TIMI 2-3 - у 708 из 984 больных (72%).
Геморрагический инсульт был у 9 (0,3%) больных при неинвазивной стратегии (ТЛТ) и у 3 (0,3%) больных -при фармакоинвазивной.
Смертность за время госпитализации была несколько выше в неивазивной группе по сравнению с фармакоинвазивной - 4,5 и 3,2% соответственно.
Количество кровотечений, потребовавших переливания крови, и малых кровотечений в течение 7 сут было одинаково в обеих группах и составило соответственно 0,7 и 2,5% (табл. 2, 3).
Приведенные данные эффективности и безопасности препарата Фортелизин®, основанные на мониторинге 4123 больных с ИМпST, говорят о результатах, сопоставимых с применением зарубежных тромболитиков алтеплазы и тенектеплазы. В настоящее время в инструкции по медицинскому применению препарата Фортелизин® разрешены болюсный (двойной болюс) и болюсно-инфузионный (30 мин) способы введения.
В целях изменения Инструкции по медицинскому применению препарата Фортелизин® в части однократного болюсного введения в соответствии с разрешением Министерства здравоохранения РФ № 261 от 16.05.014 закончено многоцентровое рандомизированное открытое сравнительное исследование эффективности и безопасности однократного болюсного введения препаратов
Фортелизин® и Метализе® у больных с ИМпST, которое позволит расширить применение Фортелизина®, особенно на догоспитальном этапе, в скорой медицинской помощи.
В рамках стратегии импортозамещения, а также учитывая актуальность вопроса проведения тромболитической терапии на догоспитальном и раннем госпитальном этапах больным с острым инфарктом миокарда, Правительство РФ включило оригинальный отечественный лекарственный препарат Фортелизин® (рекомбинантный белок, содержащий аминокислотную последовательность стафилокиназы) в обновленный Перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов для медицинского применения на 2017 г. (Распоряжение Правительства РФ от 28.21.2016 № 2885-р) [15].
ЛИТЕРАТУРА
1. CoLLen D. StaphyLokinase: a potent, uniqueLy fibrin-seLective thromboLytic agent // Nat. Med. 1998. VoL. 4, N 3. P. 279-284.
2. CoLLen D., Lijnen H.R. StaphyLokinase, a fibrin-specific pLasminogen activator with therapeutic potentiaL? // BLood. 1994. VoL. 84, N 3 P. 680-686.
3. Vestraete M. Third-generation thromboLytic drugs // Am. J. Med. 2000. VoL. 109. P. 52-58.
4. Kunadian V., Gibson C.M. TromboLytics and myocardiaL infarction // Cadriovasc. Ther. 2012. VoL. 30. P. 81-88.
5. Vanderschueren S., Dens J., Kerdsinchai P. et aL. Randomized coronary patency triaL of doubLe-boLus recombinant staphyLokinase versus front-Loaded aLtepLase in acute myocardiaL infarction. Acute Ischemic Heart Disease // Am. Heart J. 1997. VoL. 134, N 2. Pt 1. P. 213-219.
6. A randomized muLticenter triaL comparing recombinant staphyLokinase with recombinant tissue-type pLasminogen activator in patients with acute myocardiaL infarction / Department of CardioLogy, Zhongshan HospitaL, Fudan University, Shanghai 200032. China // Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 2007. VoL. 35, N 8. P. 691-696.
7. Szarka S.J., Sihota E.G., Habibi H.R. et aL. StaphyLokinase as a pLasminogen activator component in recombinant fusion proteins // AppL. Environ. MicrobioL. 1999. VoL. 65, N 2. P. 506-513.
8. Sazonova I.Y.,. Houng A.K et aL. The mechanism of a bacteriaL pLasminogen activator intermediate between streptokinase and staphyLokinase // J. BioL. Chem. 2001. VoL. 276, N 16. P. 1260912613.
9. CoLLen D. Пат. ЕАПО № 000121 от 30.06.1998 г. Новые производные стафилокиназы.
10. Moons L., VanLinthout I., RoeLants I. ToxicoLogy studies with recombinant StaphyLokinase and with SY 161-P5, a poLyethyLene gLycoL-derivatized cysteine-substitution mutant // ToxicoL. PathoL. 2001. VoL. 29, N 3. P. 285-291.
11. Маркин С.С. и др. Пат. РФ 2156299 от 20.09.2000. Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая полную последовательность стафилокиназы, штамм Escherichia coLi SA 9325 -продуцент рекомбинантного белка.
12. Вилькин Я.Ф., Маркин С.С., Семенов А.М. и др. Пат. РФ 2483750 от 10.06.2013 г. Способ лечения больных с острым инфарктом миокарда с подъемом сегмента ST.
13. Маркин С.С., Семенов А.М., Арзамасцев Е.В. и др. Доклинические и клиническое исследование фибринселективного тромболитического препарата Фортелизин® // Мед. академ. журн. 2012. Т. 12, № 1. С. 80-86.