Ишемическая болезнь сердца (ИБС) и ее проявление - острый инфаркт миокарда (ОИМ) в настоящее время являются ведущими причинами смерти и развития целого ряда опасных осложнений во всем мире [1]. За последние десятилетия достигнут значительный прогресс в лечении ОИМ благодаря широкому внедрению своевременной тромболитической терапии и раннего чрескожного коронарного вмешательства (ЧКВ), что прежде всего привело к снижению госпитальной летальности [2, 3]. Вместе с тем до сих пор существуют пациенты, которым по определенным причинам не оказывается своевременная реперфузионная терапия или она бывает неэффективной.
Актуальным остается изучение возможностей регенеративной терапии с использованием стволовых клеток. Первые клинические работы по клеточной терапии показали весьма оптимистичные результаты: косвенно была доказана возможность улучшения неоваскуляризации ишемизированного миокарда, а также безопасность и хорошая переносимость клеточной кардиомио-пластики [4, 5]. Тем не менее последние метаанализы исследований по клеточной терапии при ОИМ продемонстрировали, что краткосрочные результаты рандомизированных исследований в отношении эффективности были чрезмерно оптимистичны [6, 7]. Важно отметить, что в настоящее время опубликованы лишь единичные работы, в которых наблюдение за пациентами после клеточной терапии при ОИМ проводилось более 1 года [8-10].
Доказано, что существенный вклад в неоваскуляризацию при клеточной терапии вносят паракринные эффекты, т.е. способность трансплантируемых клеток секретировать биологически активные молекулы, в том числе ангиогенные факторы роста (АФР). И именно эта активность клеток, а не их дифференцировочные свойства, определяет их ангиогенную и тканепротективную эффективность [11, 12].
Таким образом, несмотря на большое количество исследований, в настоящее время недостаточно данных об отдаленных клинико-инструментальных результатах трансплантации АМККМ при ОИМ. Кроме того, существующие представления об участии АФР в репарации после ОИМ не определили влияние того или иного маркера на эффективность клеточной терапии при ОИМ.
Цель исследования - изучить отдаленные клинические результаты трансплантации аутологичных мононуклеарных клеток костного мозга при ОИМ с подъемом сегмента ST и факторы, влияющие на эффективность клеточной терапии.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В открытое рандомизированное исследование, зарегистрированное на сайте Clinicaltrials.gov под названием ESTABOMA, включено 62 пациента с диагнозом "первичный ОИМ с подъемом сегмента ST". Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом. Все пациенты подписали информированное согласие. Критерии включения: первичный ОИМ с подъемом сегмента ST, время достижения реперфузии инфарктсвязанной коронарной артерии (ИСКА) не ранее 4ч от начала ОИМ. Пациенты были рандомизированы методом конвертов на 2 группы: 1-я группа (основная) - проводилось стентирование на 13,1±9,34 [Me (Q25-Q75): 13,5 (8,0; 20,0)] ИСКА, затем трансплантация АМККМ на 20+10-й [Me (Q25-Q75): 19,7 (14,0; 22,5)] день ОИМ (n=28), 2-я группа (контрольная) - проводилось только стентирование ИСКА на 12,9+10,1 [Me (Q25-Q75): 13,5 (9,0; 16,7)] (n=34).
По основным демографическим, анамнестическим, клиническим показателям (возрасту, полу, факторам риска ИБС, предшествующим сердечно-сосудистым заболеваниям (ССЗ), среднему времени реперфузии ИСКА, по частоте первичной и отсроченной ЧКВ, локализации ИМ, степени поражения коронарного русла, осложнениям ИМ, сопутствующей патологии) статистически значимого различия между группами не выявлено. Все пациенты получали лечение ОИМ согласно национальным рекомендациям. В связи с особенностью организации медицинской помощи больным с ОИМ в Томске в 2003-2005 гг. большинству из включенных пациентов при отсутствии противопоказаний проводилась тромболитическая терапия (ТЛТ) (у 90% больных), при ее неэффективности либо невозможности проведения осуществлялось первичное ЧКВ (у 29% пациентов), в случае успешной ТЛТ - отсроченное ЧКВ (у 71% больных). По принципам применявшейся терапии ОИМ группы были сопоставимы (табл. 1).
&hide_Cookie=yes)
Процедуры выделения клеток и их трансплантации. За 4-5 ч до трансплантации проводилась пункция передневерхней ости крыла подвздошной кости под местной анестезией для получения аспирата костного мозга в объеме 100 мл. Далее методом градиентного центрифугирования (градиент плотности Histopaque-1077) выделялись мононуклеарные клетки, которые потом для подсчета их жизнеспособности были окрашены витальным красителем - трипановым синим. Таким образом, получено 93,0±43,0х106 АМККМ (из них 2,71±0,64х105 CD34+ и 0,53±0,17х105 CD34±CD38-) с высокой выживаемостью (98%). АМККМ вводили интракоронарно методом пассивного пассажа в течение 5 мин после эффективного стентирования ИСКА.
До проведения ЧКВ и трансплантации АМККМ, а также на 2, 5, 12-е сутки после инвазивных процедур проводили забор крови для определения АФР: гепацитарного фактора роста (HGF), сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), фактора роста фибробластов (FGF), инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF1). Определение факторов роста выполнено иммуноферментным методом (ELISA-тест).
Через 2 нед после лечения проводилась однофотон-ная эмиссионная компьютерная томография с хлоридом таллия-199 с нагрузочным тестом с аденозином. Сцинтиграфическое исследование выполнено на гамма-камере "Омега-500" (Technicare, США-Германия).
Контрольное обследование и конечные точки
Через 7,96+0,96 года после ОИМ оценивали клиническое состояние пациентов, течение болезни, определяли толерантность к физической нагрузке (ТФН) с помощью теста 6-минутной ходьбы (ТШХ), сывороточный уровень BNP определили с помощью панели Triage BNP Test на анализаторе "Triage Meter", Biosite (США). Выполнена эхокардиография на ультразвуковой системе "VIVID 7, GE Vingmed Ultrasound, Norway". В качестве конечных точкек определены: смерть, повторный ИМ, нестабильная стенокардия, стенокардия напряжения (СН) II и более функционального класса (ФК), ХСН II и более ФК, острое нарушение мозгового кровообращения (ОНМК). Показатели безопасности: вновь выявленные клинически значимые нарушения ритма сердца и онкологические заболевания.
Статистическая обработка материала
Для анализа фактического материала использовали прикладные статистические программы SAS8, SPSS 19 и R. Количественные данные представлены в виде средней величины (M) и стандартного отклонения (SD), средней величины (M) и 95% доверительного интервала (ДИ), медианы (Me) и межквартильного размаха (Q25-Q75 - 25-й и 75-й процентили). Характер распределения признаков оценивали с помощью критериев Колмогорова-Смирнова с поправкой Лиллиефорса, Шапиро-Вилка, а также методом визуализации гистограмм. Однородность генеральных дисперсий оценивали с помощью теста Левена. Для проверки статистических гипотез при анализе количественных показателей использовали: при сравнении двух независимых групп - критерий Манна-Уитни, для попарного сравнения двух зависимых групп - критерии знаков и Вилкоксона. При анализе качественных признаков проводили анализ таблиц сопряженности: для независимых групп использовали критерий χ2 Пирсона, если имелись ячейки с ожидаемой частотой меньше 5, применяли двусторонний точный критерий Фишера и критерий χ2 с поправкой Йетса (для таблиц 2x2). Для исследования взаимосвязей между переменными применяли корреляционный анализ с расчетом коэффициентов ранговой корреляции Спирмена, Кендалла и Гамма. Критический уровень значимости p для всех используемых процедур статистического анализа данных принимали равным 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Получена информация о жизненном статусе 58 больных (94%): 26 пациентов из 1-й группы, 32 - из 2-й группы. Клиническое обследование прошли 44 (73%) пациента, 14 (23%) - умерли: 10 - из 1-й группы, 4 - из 2-й группы. Частота развития конечных точек и показателей безопасности представлена в табл. 2.
&hide_Cookie=yes)
В основной группе были достоверно выше по сравнению с контрольной как общая, так и сердечно-сосудистая летальность. При анализе частоты развития повторных ИМ, ОНМК, проведения повторных оперативных вмешательств в целях реваскуляризации миокарда, диагностики стенокардии напряжения II и более ФК значимых различий между группами не выявлено. Однако в течение 7,96±0,96 года после ОИМ в группе контроля частота госпитализаций с диагнозом "нестабильная стенокардия" было достоверно больше, чем в основной. ХСН II и более ФК также чаще наблюдалась в контрольной группе, диагноз ХСН II А и более степени чаще устанавливался также во 2-й группе. По результатам ТШХ различий между группами не выявлено (499,0+92,5 в основной группе против 488,2+189,8 м в группе контроля). Сывороточный уровень BNP в обеих группах был умеренно повышен - 148,98 [62,2-235,7] против 179,68 [51,2-308,1], р=0,1.
Немаловажным аспектом была оценка безопасности трансплантации АМККМ в отношении развития проаритмических эффектов, онкопатологии. По результатам нашего наблюдения за истекший период частота развития нарушений ритма сердца и онкологических заболеваний в обеих группах существенно не различалась (см. табл. 2).
В нашем исследовании из анализа динамики эхокардиографических показателей были исключены пациенты, перенесшие повторные ИМ (табл. 3). Мы не установили влияния трансплантации АМККМ на показатели насосной, глобальной систолической функции, а также на локальную сократимость левого желудочка.
Проведен анализ базисного лечения ИБС, которое пациенты получали в течение всего периода наблюдения. В группе трансплантации АМККМ среди пациентов, прошедших контрольное обследование, наблюдалась меньшая приверженность к назначенной медикаментозной терапии. Согласно результатам теста Мориски-Грина, комплайентных к назначенной медикаментозной терапии (ответившими "нет" как минимум на 3 из 4 вопросов теста) было достоверно больше в контрольной группе (25% против 40, р=0,045), что должно было способствовать более благоприятному течению заболевания.
Наиболее часто принимаемыми препаратами были дезагреганты (аспирин и его аналоги), β-блокаторы, в значительно меньшей степени - ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента (иАПФ) и статины. Результаты продемонстрированы на рисунке. Однако статистически значимых различий между группами по получаемой медикаментозной терапии не выявлено (р>0,05).
Мы предполагали, что трансплантация АМККМ может изменить сывороточные уровни факторов роста, способствуя васкулогенезу. Тем не менее такого воздействия не установлено. В представленном исследовании при анализе концентраций АФР в крови у больных в разные сроки ОИМ обнаружена их разнонаправленная динамика, однако значимых различий по абсолютным значениям АФР и их динамике между группами не выявлено (табл. 4).
&hide_Cookie=yes)
Проведен корреляционный анализ между сывороточными уровнями АФР до вмешательства и развитием конечных точек, результаты представлены в табл. 5. Установлены положительные корреляционные связи между концентрацией в крови FGF до ЧКВ и развитием повторного ИМ в отдаленный период наблюдения как в группе трансплантации АМККМ (R=0,4; р=0,02), так и в группе контроля (R=0,3; р=0,005), а также с диагностикой нестабильной стенокардии в группе контроля (R=0,3; р=0,03). Обнаружено, что большая частота повторных ОИМ наблюдалась у пациентов с более высоким уровнем FGF при ОИМ (21,8 против 16,4 пг/мл; p=0,02). Мы предполагаем, что повышенные уровни FGF сыворотке крови приводят к чрезмерной пролиферации фибробластов в атеросклеротических бляшках и в миокарде, что способствует усугублению ИБС и негативному постинфарктному ремоделирования сердца.
&hide_Cookie=yes)
Согласно результатам нашего исследования, в группе трансплантации АМККМ низкие сывороточные уровни VEGF до ЧКВ у пациентов с ОИМ были связаны с возникновением повторного ОИМ (R=-0,8; р=0,03) и нестабильной стенокардии (R=-0,7; р=0,001).
ОБСУЖДЕНИЕ
Безусловно, в группе трансплантации АМККМ мы закономерно ожидали более низкую как отдаленную летальность, так и частоту развития других конечных точек. Множество факторов способно повлиять на регенеративный потенциал клеточной терапии: возраст пациента, распространенность и выраженность коронарного атеросклероза, сопутствующие заболевания, любые факторы сердечнососудистого риска, и то лечение, которое пациент получал в течение всего периода наблюдения [12]. Однако в нашем исследовании по основным клинико-анамнестическим характеристикам больных на момент рандомизации, а также по срокам проведения стентирования ИСКА и при сравнении получаемой терапии в течение всего периода наблюдения группы были сопоставимы.
Мы попытались выявить факторы, определяющие недостаточную клиническую эффективность клеточной терапии АМККМ. Степень коронарной недостаточности и площадь поражения левого желудочка при ОИМ, несомненно, оказали влияние на выживаемость пациентов. Сравнительный анализ клинико-инструментальных данных пациентов группы трансплантации АМККМ в зависимости от исхода болезни выявил, что среди умерших пациентов преходящий дефект перфузии, определенный с помощью нагрузочной сцинтиграфии миокарда с таллием-199, был достоверно больше (5,1+4,2 против 14,8+9,2, р=0,014) Согласно метаанализу исследований по данной тематике, опубликованному 2012 г., наилучшие долгосрочные клинические результаты получены при трансплантации АМККМ в сроки до 7 сут, в количестве более 108 и у пациентов с выраженной дисфункцией ЛЖ [7]. Руководствуясь этими данными, можно сказать, что в нашем исследовании вводилось достаточное количество АМККМ (93±43х106) с высокой исходной жизнеспособностью (>90%). Причем введенные дозы клеток (АМККМ) были максимальными, которые можно было получить при односторонней пункции передневерхней ости крыла подвздошной кости под местной анестезией. Однако важно отметить, что популяция CD34+ клеток-предшественниц составляет только 1-2% всех АМККМ. Безусловно, существует возможность получения значительно большего количества стволовых клеток из периферической крови, но только после цитокиновой стимуляции костного мозга [13].
В исследовании С. Stamm и соавт. также было показано, что клеточная терапия более эффективна у больных с ФВ ниже 35% [14]. В нашей работе трансплантация АМККМ проводилась пациентам с незначительно сниженной либо с сохранной фракцией выброса ЛЖ (49,3+10,2%), что могло стать причиной отсутствия значимого прироста ФВ ЛЖ после клеточной терапии.
До сих пор нет единого мнения о наиболее оптимальных сроках для проведения клеточной терапии при ОИМ. Так, в исследовании SWISS-AMI при интракоронарном введении АМККМ в сроки от 5 до 7 дней либо от 3 до 4 нед после ОИМ, по данным 4-месячного наблюдения, у больных не выявлено улучшения функции ЛЖ [15]. Однако некоторые авторы полагают, что клеточная терапия более эффективна через 2-3 мес после ОИМ, после завершения активного воспалительного процесса в зоне повреждения [16].
Мы проводили трансплантацию АМККМ в среднем на 20-е сутки (14,0; 22,5) от начала заболевания. При дополнительном анализе установлено, что среди пациентов, которым проводилась трансплантация АМККМ после 20 сут ОИМ, чаще развивалась клинически значимая ХСН II и более ФК по NYHA в отдаленный период наблюдения (р=0,01) Кроме того, такие факторы микроокружения, как гипоксия, воспаление, окислительный стресс, фиброз, отсутствие опорных клеток, стимулируют апоптоз или некроз трансплантированных клеток [13]. В рамках нашего исследования ранее было установлено, что только 3,2% АМККМ, меченных радионуклидом, присутствовали в миокарде через 24 ч после интракоронарного введения [17]. Повторное интракоронарное введение АМККМ, подготовка клеток с помощью методов генной инженерии для избыточной экспрессии генов выживания или проангиогенных факторов могут значительно повысить эффективность клеточной терапии в отношении улучшения течения ИБС и профилактики ХСН.
Многие ученые сходятся во мнении, что эффективность клеточной терапии связана со стимуляцией эндогенных механизмов регенерации поврежденного миокарда и ангиогенеза за счет реализации паракринных эффектов или модуляции иммунного ответа путем секреции цитокинов и АФР [13].
Согласно результатам нашего исследования, сывороточные уровни фактора роста фибробластов и сосудистого эндотелиального фактора роста, определенные до проведения ЧКВ и трансплантации АМККМ, являются прогностически важными показателями неблагоприятного течения ИБС в отдаленные сроки после ОИМ.
Так, более высокий уровень FGF до ЧКВ (≥17,2 пг/мл) ассоциировался с неблагоприятным отдаленным прогнозом - развитием повторных ИМ как в контрольной, так и в группе трансплантации АМККМ. Наши результаты согласуются с данными ряда экспериментальных работ, где было доказано, что усиленная продукция профиброгенных факторов, так называемое перепроизводство TGF-β1, FGF, тромбоцитарного фактора роста приводит к гиперпролиферация фибробластов, повышенному синтезу коллагена и, как следствие, к последующему фиброзу тканей [18].
Однако для оценки влияния сывороточного уровня данных АФР на эффективность трансплантации АМККМ требуется проведение дополнительных исследований с включением большего количества пациентов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Клеточная кардиомиопластика аутологичными мононуклеарными клетками костного мозга считается безопасной процедурой, однако она не оказывает положительного влияния на отдаленную выживаемость пациентов в течение 7,96+0,96 года наблюдения. Относительно низкая возможность удержания клеток костного мозга в зоне ИМ, поздние сроки проведения трансплантации от начала ОИМ (после 20 сут) являются вероятными причинами недостаточной эффективности трансплантации АМККМ при ОИМ.
Работа выполнена на базе ФГБНУ "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук", Научно-исследовательский институт кардиологии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Mozaffarian D., Benjamin E.J., Go A.S. et al. Heart disease and stroke statistics - 2015 update: a report from the American Heart Association // Circulation. 2015. Vol. 131, N 4. P. 29-322.
2. Widimsky P., Wijns W., Fajadet J. et al. European Association for Percutaneous Cardiovascular Interventions. Reperfusion therapy for ST elevation acute myocardial infarction in Europe: description of the current situation in 30 countries // Eur. Heart J. 2010. Vol. 31, N 8. P. 943-957.
3. Марков В.А., Рябов В.В., Максимов И.В. и др. Вчера, сегодня, завтра в диагностике и лечении острого инфаркта миокарда // Сибир. мед. журн. 2011. № 2. C. 8-14.
4. Wollert K.C., Meyer G.P., Lotz J. et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial // Lancet. 2004. Vol. 364. P. 141-148.
5. Chen S.L., Fang W.W., Ye F. et al. Effect on left ventricular function of intracoronary transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cell in patients with acute myocardial infarction // Am. J. Cardiol. 2004. Vol. 94, N 1. P. 92-95.
6. GyongyosiM., WojakowskiW., Lemarchand P. et al. Meta-analysis of cell-based cardiac studies (ACCRUE) in patients with acute myocardial infarction based on individual patient data // Circ Res. 2015. Vol. 116. P. 1346-1360.
7. Clifford M.D., Fisher S.A., Brunskill S.J. et al. Long-term effects of autologous bone marrow stem cell treatment in acute myocardial infarction: factors that may influence outcomes // PLoS One. 2012. Vol. 7, N 5. P. 1-9. URL: www.plosone.org.
8. Leistner D.M., Fischer-Rasokat U., Honold J. et al. Transplantation of progenitor cells and regeneration enhancement in acute myocardial infarction (TOPCARE-AMI): final 5-year results suggest long-term safety and efficacy // Clin. Res. Cardiol. 2011. Vol. 100, N 10. P. 925-934.
9. Feng C., Dongdong S. at al. Long-term myocardial functional improvement after autologous bone marrow mononuclear cells transplantation in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: 4 years follow-up // Eur. Heart J. 2010. Vol. 30. P. 1986-1994.
10. Yousef M., Schannwell C.M., Kostering M. et al. The BALANCE Study: clinical benefit and long-term outcome after intracoronary autologous bone marrow cell transplantation in patients with acute myocardial infarction // J. Am. Coll. Cardiol. 2009. Vol. 53, N 24. P. 2262-2269.
11. Парфенова Е.В., Ткачук В.А.. Терапевтический ангиогенез: достижения, проблемы, перспективы // Кардиол. вестн. 2007. Т. 2, № 2. С. 5-15.
12. Madonna R., Van Lake L.W., Davidson S.M. et al. Position Paper of the European Society of Cardiology Working Group Cellular Biology of the Heart: cell-based therapies for myocardial repair and regeneration in ischemic heart disease and heart failure // Eur. Heart J. 2016. URL: http://eurheartj.oxfordjournals.org.
13. Pompilio G., Cannata A., Peccatori F. et al. Autologous peripheral blood stem cell transplantation for myocardial regeneration: a novel strategy for cell collection and surgical injection // Ann. Thorac. Surg. 2004. Vol. 78. P. 1808-1812.
14. Stamm C., Kleine H.D., Choi Y.H. et al. Intramyocardial delivery of CD133+ bone marrow cells and coronary artery bypass grafting for chronic ischemic heart disease: safety and efficacy studies // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2007. Vol. 133. P. 717-725.
15. Surder D., Manka R., Lo Cicero V. et al. Intracoronary injection of bone marrow derived mononuclear cells, early or late after acute myocardial infarction: effects on global left ventricular function // Circulation. 2013. Vol. 127. P. 1968-1979.
16. Байкова Ю.П. Репарация и васкуляризация инфарктной зоны миокарда у крыс после трансплантации мононуклеаров красного костного мозга : автореф. дис. ... канд. биол. наук. М., 2011.
17. Рябов В.В., Суслова Т.Е., Крылов А.Л. и др. Кардиомиопластика с помощью аутологичных и мононуклеарных клеток костного мозга у больных острым инфарктом миокарда // Тер. арх. 2006. Т. 78, № 8. С. 47-52.
18. Chen G.J., Forough R. Fibroblast growth factors, fibroblast growth factor receptors, diseases, and drugs // Recent Pat. Cardiovasc. Drug Discov. 2006. Vol. 1, N 2. P. 211-224.